توالی یابی مستقیم بر روی کلونی باکتری

توالی یابی کلنی

توالی یابی کلنی روشی است که در آن DNA پلاسمید (pDNA) مستقیماً از کلنی های میکروبی استخراج و تکثیر می شود و امکان تولید داده های توالی یابی بدون نیاز به خالص سازی پلاسمید را فراهم می کند. علاوه بر صرفه جویی در زمان با حذف مراحل آماده سازی پلاسمید، یکی دیگر از مزایای کلیدی توالی یابی کلنی، انعطاف پذیری آن با نمونه اولیه است. هر اندازه پلاسمید، با الگوی پلاسمید کپی زیاد یا کم، می تواند با توالی یابی مستقیم کلنی توالی یابی شود. توالی یابی مستقیم کلنی معمولاً برای غربالگری کتابخانه های (libraries) DNA مکمل (cDNA) و جهش زایی هدایت یافته مکانی استفاده می شود.

Rolling circle amplification (RCA)

Rolling circle amplification (RCA) در سیستم های طبیعی به عنوان مکانیزم تکثیر DNA که اغلب در انتشار پلاسمید و ویروس استفاده می شود، شناسایی شد. هنگامی که هگزامرهای تصادفی با یک رشته DNA پلیمراز جابجا می شوند، بسیاری از کپی های الگوی الحاقی بدون نیاز به ترموسایکلینگ تولید می شوند (دین و همکاران، 2001). رشته های سنتز شده پس از یک دور RCA جابجا می شوند و برای دورهای اضافی اتصال پرایمر آزاد هستند. اگر واکنش RCA حاوی آغازگرهای مکمل هر دو رشته الگو باشد، تقویت نمایی قابل دستیابی است.

Direct Colony Sequencing

خدمات Direct Colony Sequencing از RCA  براي فعال كردن توالي سنگر الگوهاي نمونه باكتريايي كلون يا فاژ بدون نياز به تهيه پلاسميد استفاده مي كند. RCA ، DNA را برای توالی یابی با پرایمینگ تصادفی هگزامری الگوهای حلقوی تولید می کند. پروتکل‌های  RCA در I cell gene می‌توانند پروژه‌های توالی‌یابی با هر اندازه‌ای را انجام دهند و برای ایجاد خوانش با کیفیت بالا از کلنی‌های باکتریایی و ذخایر گلیسرول و همچنین پلاک‌های فاژ و سوپرناتانت بهینه شده‌اند. تعیین توالی Direct Colony نیز زمانی که مقادیر کم ماده اولیه DNA در دسترس باشد (مانند پلاسمیدهای کم کپی) بسیار موثر است.

مراحل انجام RCA در I cell gene

1. پس از لیز، نمونه های باکتریایی با dNTP ها، پلیمرازها و هگزامرهای تصادفی ترکیب می شوند. هگزامرها به الگوهای حلقه‌ای anneal می‌شوند و همانندسازی در بسیاری از مکان‌ها به طور همزمان آغاز می‌شود.

 2. پلیمراز به دلیل پایداری و پردازش بالا مورد استفاده قرار می گیرد. این امکان جابجایی طولانی رشته را در چندین دور تقویت می دهد. همانطور که رشته های جدید سنتز شده جابجا می شوند، آبشاری از رویدادهای آغازگر تقویت الگو را تسهیل می کند.

3. پس از تکمیل، نمونه برای توالی سنگر آماده است.

ویژگی ها و مزایای انجام  Direct Colony Sequencing در icellGene

1. صرفه جویی در زمان و هزینه: بدون نیاز به کشت و تهیه

2. DNA داده های با کیفیت بالا: بیش از 600 پایه خواندن Phred20

3. طراحی و مشاوره پروژه: تیم بسیار آموزش دیده از متخصصان توالی یابی Sanger در سراسر پروژه در دسترس هستند.

4.پاسخ دهی سریع: داده های Sanger خود را در72 ساعت از رسید نمونه دریافت کنید.

 5. سفارش آنلاین: سامانه سفارش آنلاین و بازیابی اطلاعات 24 ساعته