توالی سنگر چیست؟
توالی یابی سنگر که به عنوان “روش خاتمه زنجیره” نیز شناخته می شود، توسط بیوشیمیدان انگلیسی فردریک سانگر و همکارانش در سال 1977 توسعه یافت. این روش برای تعیین توالی بازهای نوکلئوتیدی در قطعه ای از DNA که معمولاً کمتر از 1000 جفت باز طول دارد طراحی شده است. خدمات توالی یابی سنگر به دلیل دقت پایه 99.99% به عنوان “استاندارد طلایی” برای اعتبارسنجی توالی های DNA در نظر گرفته می شود، از جمله آنهایی که قبلاً از طریق توالی یابی نسل بعدی (NGS) توالی یابی شده اند. توالی یابی سنگر در پروژه ژنوم انسان برای تعیین توالی قطعات نسبتاً کوچک DNA انسان (900 جفت باز یا کمتر) استفاده شد. از این قطعات برای جمع آوری قطعات بزرگتر DNA و در نهایت کل کروموزوم ها استفاده شد.
توالی یابی سنگر چگونه انجام می پذیرد؟
خدمات توالی یابی سنگر که بر اساس اصل و بیوشیمی همانندسازی DNA است، دو مرحله اساسی را دنبال می کند:
- PCRبا استفاده از دی اکسی نوکلئوتیدهای پایان دهنده زنجیره فلورسنت (ddNTPs)
- جداسازی اندازه و آنالیز توسط الکتروفورز مویرگی PCR خاتمه زنجیره ای در مرحله اول، از PCR پایانی زنجیره ای برای تکثیر الگوی DNA مورد نظر استفاده می شود. این نسخه اصلاح شده PCR از همه اجزای مشابه روش PCR استاندارد استفاده می کند، اما با یک تفاوت کلیدی، افزودن دی اکسی نوکلئوتیدهای نشاندار شده با فلورسنت (ddNTPs: ddATP, ddGTP, ddCTP, and ddTTP) به مخلوط واکنش. از نظر ساختاری، ddNTP ها با دئوکسی نوکلئوتیدها (dNTPs) تفاوت دارند، زیرا کربن 3′ قند دئوکسی ریبوز به جای گروه هیدروکسیل (-OH) به یک مولکول هیدروژن (-H) متصل است. این عدم وجود گروه 3′-OH واکنش تراکم را در طول همانندسازی DNA قطع می کند و از گسترش بیشتر آمپلیکون جلوگیری می کند. نتیجه بسیاری از این واکنش ها تعداد زیادی از قطعات DNA فلورسنت است که در طول های تصادفی به پایان می رسند.
جداسازی اندازه و آنالیز توسط الکتروفورز مویرگی(capillary electrophoresis) در مرحله دوم، قطعات DNA خاتمه یافته با زنجیره فلورسنت جدا شده و از طریق الکتروفورز مویرگی شناسایی می شوند. در این روش، قطعات DNA به صورت الکتروکینتیک به مویرگ های بسیار نازک پر از پلیمر تزریق می شوند و تحت تأثیر میدان الکتریکی از طریق آرایه مویرگی مهاجرت می کنند. قطعات بر اساس اندازه از هم جدا می شوند و کوچکترین قطعات سریعترین حرکت را دارند. همانطور که آنها از پنجره تشخیص عبور می کنند، یک لیزر برچسب های فلورسنت در هر باند را تحریک می کند و نور ساطع شده به صورت طیفی جدا شده و توسط یک دوربین CCD ثبت می شود. نرمافزار، دادههای خام را تجزیه و تحلیل میکند و آنها را بهعنوان یک کروماتوگرام که پیک فلورسنت هر نوکلئوتید را در طول الگوی DNA نشان میدهد، خروجی میدهد.
